Laserinduzierte Fluoreszenz (LIF)
Die Messung der laserinduzierten Fluoreszenz (LIF) ist ein weit verbreitetes Verfahren, das extrem hohe Nachweisempfindlichkeiten bis hin zum Einzelmolekül-Nachweis ermöglicht. LIF wird vielfach in der Forschung, der Bio- und Umweltanalytik sowie in der medizinischen Diagnostik eingesetzt.
- Feste, flüssige und gasförmige Proben, biologische Proben (Gewebe)
- Berührungs- und zerstörungsfrei
- Intrinsische Fluoreszenz und Markerfluoreszenzen
- Gleichzeitige Detektion mehrerer Fluoreszenzen
- Messung von Fluoreszenzlebensdauern und –polarisation
- Zwei- und Mehrphotonen-induzierte Fluoreszenz
Prinzip der laserinduzierten Fluoreszenz
Der Laserstrahl wird von der Probe absorbiert. Dabei werden die Probenmoleküle in einen höheren elektronischen Zustand angeregt. Beim Relaxieren in den Grundzustand emittieren die Moleküle Fluoreszenzquanten bei höheren Wellenlängen als der Laserwellenlänge und mit charakteristischen Lebensdauern. Durch eine gute Separation der Fluoreszenz von der Laserstrahlung mit Hilfe von geeigneten Filtern sind höchste Nachweisempfindlichkeiten erreichbar. Unter Verwendung von kurz-gepulsten Lasern mit Femto-, Piko- oder Nanosekunden-Impulsdauern kann die Schnelligkeit gemessen werden, mit der die angeregten Moleküle relaxieren. Typischerweise liegen die Fluoreszenzlebensdauern im Bereich von Pikosekunden bis Nanosekunden. Im Falle von „verbotenen“ elektronischen Übergängen können aber auch Lebensdauern von Mikro-oder Millisekunden auftreten. Solche langlebigen Fluoreszenzen sind außerordentlich interessant für bioanalytische Anwendungen.
Mikro- und makroskopische LIF
Fluoreszenzmessungen lassen sich bequem mit Mikroskoptechniken kombinieren. Es gibt eine Reihe von Verfahren, bei denen Proben 2- und 3-dimensional mit Mikrometerauflösung abgetastet werden und bei denen zusätzlich Fluoreszenzlebensdauern bestimmt werden. Zu diesen Methoden gehören die konfokale Laserfluoreszenzmikroskopie, Fluoreszenzimaging (FI), Fluoreszenzlebensdauerimaging (FLIM) und die Mehrphotonen-Fluoreszenztomographie. Anwendung finden diese Techniken vornehmlich in der Forschung im Bereich der Lebenswissenschaften, in der Wirkstoffforschung und in der Labordiagnostik. Auch für makroskopische Anwendungen ist LIF sehr gut geeignet. Routineanwendungen sind z.B. die quantitative Echtzeit-PCR, die Analyse von Fluoreszenzassays in der Pharmaforschung/-entwicklung bzw. der Labordiagnostik oder in der Forensik. Häufig wird die einfache Kombinierbarkeit mit faseroptischer Sondentechnik für Remote- bzw. in-situ-Anwendungen genutzt. Wird eine gepulste Laseranregung, wie sie mit Stickstofflasern von LTB Lasertechnik Berlin möglich ist, mit getorter Nachweistechnik (ICCD-Detektoren) kombiniert, so kann eine weitgehende Unempfindlichkeit der Fluoreszenzmessung von Umgebungslicht erreicht werden.
2D-laserinduzierte Fluoreszenz
Für die 2D-aufgelöste Fluoreszenzspektroskopie werden meist Fluoreszenzemissionsspektren bei kontinuierlich variierenden Anregungswellenlängen aufgenommen und so ein Exzitations-/Emissionsraum aufgespannt. Die vertikale z-Achse wird durch die Fluoreszenzintensität gebildet. Kombiniert mit chemometrischen Datenanalysemethoden können so Applikationen in der Prozessanalytik erschlossen werden. Das LIMES Fluoreszenzspektrometer bietet als Besonderheit serienmäßig die Eigenschaft, 2D-Fluoreszenzspekten aufnehmen zu können, wobei anstelle der Anregungswellenlänge das Abklingverhalten der Fluoreszenz auf einer Nanosekundenachse abgebildet wird. Da gerade die Lebensdauer der Fluoreszenz empfindlich von Struktur und Zustand der Probe abhängt (Bindungszustand, pH-Wert, Mikroumgebung, Aggregatzustand, etc.), können mit dieser Zeitdimension neuartige Analyseverfahren für vielfältige Anwendungen erschlossen werden.
